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最前沿的样品前处理技术都在这了!!!

样品前处理的主要目的

1、基体或共存物质干扰(干扰消除)

2、样品浓度调节(浓缩、富集、稀释)

3、样品介质不适合后续分离或检测(介质置换)

4、避免系统污染,延长仪器寿命(仪器保护)


固体样品中被测物的溶出技术

1、溶解:被测物全部溶解,基体全部或大部分溶解(残渣)

  水溶、酸溶、碱溶、有机溶剂。


2、提取(浸取):被测物和少部分基体物质溶解进入溶液

(快速)索氏提取、微波/超声辅助,加速溶剂提取。


3、消解(裂解、降解):破坏基体,释放出目标物质。

  湿法:强氧化性酸解、微波消解、光解、酶解。

  干法:灰化、熔融、氧弹(氧瓶)燃烧、裂解、燃烧炉。


样品净化新技术

1、液相萃取:双水相、浊点、胶团、离子液体,微萃取

2、固相萃取:基质分散SPE、磁SPE、微萃取

3、色谱:GPC-色质、柱切换(在线干扰消除/在线富集)

4、电化学:原位电沉积、电渗析、电泳(薄膜、凝胶)

5、膜分离:超滤、透(渗)析、微透析、仿生膜

6、超分子分离:主客体配合物、分子印迹、亲和(免疫磁珠)

7、其他:超速离心、超临界流体萃取、分子蒸馏、芯片分离


样品前处理技术发展趋势

1、自动化(加速溶剂提取、SPE、稀释/浓缩)

2、在线化(GPC-色质、SPE-色谱/色质、CIC、超滤-IC)

3、微量化(液相/固相微萃取、芯片分离)

4、多任务(平台)(稀释-渗析、固相萃取-浓缩)

5、专门化(QuEChERS法、顶空-GC、氢化物发生-原子荧光)


重要技术进展举例


一、液相微萃取(LPME)

1996年在液液萃取基础上发展起来,结合了液液萃取和固相微萃取的优点。只需极少量的有机溶剂、装置简单、操作方便、成本低;适合萃取在水溶液中溶解度小的痕量目标物;方便与后续分析仪器连接,实现在线样品前处理。


最初的液相微萃取—单滴微萃取(single-drop microextraction)

一滴溶剂直接悬挂于色谱进样针尖,将其浸入样品水溶液(或样品顶空气相)中,分析物萃取到有机溶剂液滴中,直接注入色谱仪分析(分离+进样)。


缺陷:悬挂于针尖的有机溶剂液滴在搅拌样品时容易脱落。

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1.多孔中空纤维液相微萃取

改进方法:将多孔中空纤维管固定在针头上保护和容纳有机萃取剂。同时,纤维的多孔性增加了溶剂与样品接触的表面积,从而提高萃取效率。 

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2.多孔纤维液相微萃取的萃取模式

两相LPME :

中空纤维管内吸入萃取相(有机溶剂,还可在萃取溶剂中加入萃取剂),纤维管壁微孔内也浸满萃取相。目标物萃取到纤维腔内,在萃取溶剂相和样品水相之间达到分配平衡。萃取相可直接进样分析。


三相LPME:

中空纤维管壁微孔内浸入的是有机萃取剂,而纤维腔内吸入的是水溶液接收相。有机萃取剂成了样品水溶液和接收相水溶液之间的隔断。

目标物先被有机萃取剂从样品水溶液中萃取出来,然后进入管内接收相水相。接受相可直接注入色谱仪分析。


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3.简易动态三相微萃取

有机溶剂(萃取相)浸渍的中空纤维套在注射器前端,注射器内存有少量接受液,推动注射器反复更新中空纤维内的接受相,可提高富集倍数。

如:水样中芳胺萃取。

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4.动态液滴微萃取

是一种微量样品富集+进样的技术,样品富集机理为液液萃取。

例如:水样中的十二烷基硫酸钠,与亚甲基兰形成离子对,用氯仿液滴(约1.3μl)收集,用光学检测法检测。

若样品为多成分,可将富集后的样品液滴直接引入色谱系统进行分离检测。

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滴对滴溶剂微萃取(drop-to-drop solvent microextraction

样品溶液和萃取溶剂都只有一滴体积大小;适合珍贵样品溶液的前处理;萃取平衡快。

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悬滴式微萃取(directly suspended droplet microextraction)

定量吸取萃取溶剂直接滴于样品溶液上,萃取一定时间后,用微量取样针插入液滴内部定量吸取样品,做后续分析。

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分散液-液微萃取(DLLME )

萃取相是由少量(如10-50μL)萃取溶剂与数倍量(如0.5-1.5mL)分散剂混合而成,用注射器将萃取相快速注入离心管中的数mL样品溶液中,萃取相即以细小液滴形式分散于样品溶液中,相当于多个液滴微萃取。离心分离使萃取相聚集于底部,吸取萃取相分析。主要用于水样中有机物污染物,特别是农残的富集。

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实例:DLLME分离富集水样中拟除虫菊酯类农药残留

取5.0mL经0.45μm滤膜过滤后的水样于10mL具塞尖底离心试管中,加10μL氯苯(萃取溶剂)和1.0mL丙酮(分散剂),轻轻振荡1min,即形成一个水/丙酮/氯苯的乳浊液。氯苯均匀地分散在水相中,室温放置2min,以5000 r/min离心5min,萃取溶剂氯苯沉积到试管底部,用微量进样器吸取1μL萃取溶剂直接进样做GC分析。

二、固相微萃取(SPME)


固相微萃取(SPME)

SPME装置类似色谱进样针,针头(石英纤维头)外表面涂有高分子涂层,有机分析物遵循“相似相溶”原理被萃取富集到固相涂层。称为纤维针式SPME。与色谱在线联用。集进样、萃取、浓缩功能于一体。

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针式SPME的特点:

(1)结构简单,操作方便;

(2)萃取速度较快;

(3)不使用有机溶剂;

(4)适合现场采样;

(5)支持材料较多,纤维萃取头易折断,后来又发展了不锈钢、陶瓷、金属丝、碳材料等支持体材料;

(6)涂层易流失,重复性较差。

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SPME的三种操作模式

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(A)直接萃取:适合气体和较干净液体样品中低挥发性或中等挥发性目标组分的萃取。不适合复杂样品、强酸强碱性样品(涂层易遭到破坏)。

(B)顶空萃取:适合复杂液体或固体样品中高挥发性或中等挥发性组分的萃取。

(C)膜保护萃取:适合复杂基体中低挥发性组分的萃取。


固相微萃取搅拌棒(SBSE)

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SBSE技术的优点:

(1)萃取固定相的容量大;

(2)自身完成搅拌,避免竞争吸附。 

缺点:

(1)需要特制的解吸器;

(2)萃取所需平衡时间长。


薄膜微萃取(TFME)

将薄膜(如PDMS薄膜)切成像房子侧面的形状:2cm×2cm的正方形上带有一个1cm高的三角形。

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将其附着在一些刚性支撑物上,例如不锈钢丝、不锈钢网或特氟龙片等,插入搅拌的溶液中进行萃取。

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TFME也可用于气体或顶空样品分析。


三、磁分散固相萃取

磁固相萃取(Magnetic solid phase extraction, MSPE)采用具有磁性或可磁化材料作为固定相,通常分散SPE形式应用。

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特点:相分离简便快速!


磁性吸附剂

核壳型磁性微球:通常以磁性无机纳米(亚微米、微米)微球(如Fe3O4)为核,磁核表面包覆具有活性基团的过渡层(除提供修饰位点外,还可引导功能材料在核上生长,避免自聚成核生长出次生颗粒),再在过渡层外修饰具有不同吸附作用的有机功能层。(磁核+过渡层+功能层) 


磁性复合(非核壳)材料:以具有特殊结构和吸附能力的材料(如碳纳米管、石墨烯、聚合物)作为载体,在其表面或网络结构中复合磁性粒子。


核壳型磁颗粒的壳层制备

壳层的作用: 

Fe3O4颗粒易氧化破坏,需要包覆层保护;

Fe3O4颗粒易团聚,壳层材料可提高分散性能;

Fe3O4颗粒表面吸附作用弱,且缺乏选择性,需功能壳层;

中间壳层(过渡层):Fe3O4颗粒表面的活性基团反应性和选择性不够强,需先包覆特定中间层,再进行功能修饰。


核壳型介孔磁性微球

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Fe3O4@SiO2@C18疏水有机功能层磁性微球


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Fe3O4@C@CHI制备流程图


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化学键合法制备离子液体磁颗粒


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磁性氧化石墨烯复合材料(生物样品中重金属离子分析的前处理)

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氨基酸修饰的磁性氧化石墨烯AMGO/Fe3O4


吸附剂对牛血红白蛋白具有选择性吸附作用

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四、 渗析(透析)

渗析现象:半透膜两侧分别放置溶液和纯水,或者在膜两侧放置不同浓度的溶液,只有溶液中的小分子可以穿过半透膜,从高浓度一侧向低浓度一侧移动。

渗析是受扩散控制,以浓度梯度为驱动力的膜分离方法。

渗析与渗透本质上相同,但所用膜不同。渗透膜不允许溶质通过,只有溶剂通过;而渗析膜允许小分子溶质通过。

用于清除蛋白质溶液中的盐类等小分子杂质;在医学领域用于血液透析。

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微透析技术

微透析针插入活体动物组织,灌流液由注射器推入膜内套管,体液中小分子、离子扩散穿过透析膜进入采样针内(阻止蛋白质等大分子通过)。

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微透析技术的特点

活体(In vivo)、实时(In time)、在线(On line)

时间分辨性(不同时间物质含量的变化)。

空间分辨性(不同器官、组织部位物质含量的变化)。

提供游离态小分子化合物,对药物研究有重要意义。

样品因不含蛋白质、酶等大分子物质,可不经预处理直接用于IC、HPLC测定。

不足: 回收率低,通常在15%左右。 


微透析作为ESI-MS除盐接口


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五、亲和分离技术

亲和作用:通常指生物分子之间的特异性相互作用。如抗原与抗体、酶与底物、核酸与互补碱基链之间。

亲和分离材料:含亲和功能基团的材料。如膜、吸附剂。

亲和分离方法:亲和SPE、亲和色谱、亲和膜分离、亲和层析、亲和沉淀、亲和萃取、亲和过滤。

亲和配基

天然特异性配基:如免疫亲和配基(抗体与抗原)。 

天然基团性配基:核苷酸、凝集素、苯甲醚、肝素、硼等。

人工合成配基:生物活性染料及金属离子。

 天然配基对特定生物分子具有内在的生物特异性作用,而合成配基则需通过优化偶合和洗脱条件来实现其特异性作用。

天然配基性能优于合成配基,但天然配基制取提纯困难、价格昂贵、使用条件苛刻。实际多使用量大且便宜的配基,如生物活性染料,其可与多种脱氢酶、碱性磷酸酯酶、羧肽酶、白蛋白等结合。


1.亲和膜分离

利用膜的孔径大小及亲和基团的生物特异选择性,不受相对分子量大小的限制。

原则上讲,只要选择合适的膜,共价键合上能与目标物质产生亲和相互作用的配位基,就可以从复杂体系,尤其是细胞培养液和发酵液中分离和制备出任何一种目标物。


2.亲和膜分离原理


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3.亲和膜超滤

膜孔径30-100nm。样品溶液流过膜时,与配基产生亲和作用的分子被截留在膜上,其他生物大分子顺着液流进废液槽;而部分溶剂则透过膜流到溶剂槽中。

优点:不仅目标生物大分子可与和其他分子分离,而且同时可去除部分溶剂(浓缩)。

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4.亲和膜微滤

孔径在0.3~3μm。能与配基产生亲和作用的生物分子被膜上的配基“抓住”,其他分子和溶剂透过膜。

用合适的顶替试剂洗脱后分析,进一步用透析、凝胶过滤等除掉小分子后在分析。

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免疫磁珠(ImpetiCbead,IMB)分离

免疫磁珠是一项新的免疫学技术,它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体,以免疫学为基础,渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域,其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。


免疫磁珠分离原理

以表面覆盖高分子材料的超顺磁性颗粒(数十nm至数μm)为核,利用核表面的功能基团(如氨基、羧基、巯基等)将抗体(或抗原)修饰在颗粒表面,用于特异性吸附相应的抗原(或抗体)。

通过外加磁场使吸附了目标物的磁珠从样品溶液分离出来,洗脱后分析。

应用:基因、蛋白质、细胞、微生物等的分离纯化。

六、在线燃烧炉消解


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特点与应用:

分析对象:难降解样品中卤素与硫的分析。

特点:全自动,消解彻底,全封闭体系目标组分物损失。

应用领域:环境(塑料废弃物、活性炭)、能源(油品、煤炭)、电子(电路板、树脂、线缆、绝缘材料)、新材料(高分子聚合物、石墨烯、OLED)、食品(油脂、香料、调味品)、制药(原料、中间物、成品)、矿物。

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